收到細胞后，首先觀察瓶身是否完好（注意有無縫隙，裂痕）；顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，有無細胞漂浮；用新潔爾滅消毒瓶口及瓶身；打開瓶口，再次用新潔爾滅消毒瓶口（可能會有液體溢出，注意不要碰到液體），酒精燈烤瓶口消毒；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml離心管或廣口瓶中（若細胞漂浮嚴重，離心培養(yǎng)基，1000g*5分鐘，將離心后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至另一個大離心管中，留一點吹打細胞沉淀成懸液，回收細胞至原培養(yǎng)瓶），若漂浮不嚴重，亦離心一下；在原培養(yǎng)瓶中留一部分原裝培養(yǎng)液，再補加自己新配的培養(yǎng)基至適當容積，例如4ml，讓細胞適應(yīng)一下環(huán)境。 當細胞長到70-80%，凍存大部分，小部分傳代。
關(guān)鍵操作規(guī)范：
復蘇流程：
快速解凍：37℃水浴中搖晃凍存管，5-10分鐘內(nèi)完成，加入4-6mL培養(yǎng)基離心去除DMSO37。
初始接種：細胞懸液置于T25瓶或6cm皿，24小時內(nèi)貼壁伸展，48小時換液。
日常維護：
換液頻率：每周2-3次，pH值穩(wěn)定在7.0-7.4。
污染防控：嚴格無菌操作，定期檢測支原體，使用雙抗預防細菌污染。
異常處理：
貼壁失敗：復蘇24小時未貼壁的細胞存活率下降30%-50%，需棄用。
消化成團：吹打力度需輕柔均勻，避免機械損傷。
注意事項：
1)細胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以離心去掉，留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細胞生長至匯合度80%，進行消化傳代；如細胞還是不貼壁，將細胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會一直跟蹤指導，直到問題解決。
2)對于生長緩慢的貼壁細胞：可采用適當?shù)奶岣吲囵B(yǎng)基中血清濃度，或隔日換液的方法來保證細胞的狀態(tài)和生長速度。
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